產品名稱：NextSeq 500/550 Mid Output v2 kit (300 cycles)

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產品貨號：FC-404-2003

適用系統(tǒng)：illumina NextSeq 500, NextSeq 550測序儀

產品介紹：

在 NextSeq 500/550上執(zhí)行測序運行需要使用一次性 NextSeq 500/550試劑盒。每個試劑盒包含一個流動槽和一次測序運行所需的試劑。流動槽、試劑夾盒和緩沖液夾盒均使用射頻識別（radio-frequency identification，簡稱RFID）進行精確的耗材跟蹤并確保兼容性。 

NextSeq 500/550 v2測序試劑盒將高通量測序系統(tǒng)的功能整合到臺式計算機中，不僅改善了數(shù)據(jù)質量，而且使無錯誤片段產率達到zui高水平。此試劑盒具有下列優(yōu)點：出色的堿基檢出，提升的信噪比

提供多種測序輸出和片段長度選擇方案

試劑夾盒配置簡化，工作流程和夾盒上樣改善

提供直觀標記和RFID編碼試劑

采用的邊合成邊測序(SBS)和橋式擴增簇生成技術，優(yōu)化化學過程

此試劑盒不僅提供強大的測序化學過程，而且將手動操作時間壓縮至短短10分鐘。直觀標記和RFID編碼試劑確保與用戶自定義的運行配置兼容。

（NextSeq 500/550 v2套件已于2018年12月31日停產; 出貨量持續(xù)到2019年2月28日.TG版本不受影響。NextSeq 500/550 v2.5套件是替代產品，與v2套件相比，具有更高的穩(wěn)定性和堅固性。）

產品名稱：illumina NextSeq 500/550 v2測序試劑盒(300 cycles)        產品貨號：FC-404-2003

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Illumina二代測序技術，邊合成邊測序（SBS），是廣泛采用的新一代測序（NGS）技術，負責產生世界上90％以上的測序數(shù)據(jù)。

Illumina的二代測序技術稱為邊合成邊測序(Sequencing-by-Synthesis,簡稱SBS)。SBS主要包括堿基延伸、熒光激發(fā)及信號收集、剪切等3個步驟。這3個步驟可以重復，循環(huán)進行。每循環(huán)一次測定一個堿基。想測定多少個堿基（即讀長），就循環(huán)多少次。測序循環(huán)次數(shù)可以在軟件里設定。到底測序多長合適，要根據(jù)項目性質和需求來決定。大多數(shù)情況下，SR實驗（單端測序）測定1x50個堿基，PE實驗（雙端測序）測定2x150個堿基。

1 堿基延伸

Illumina測序試劑里所使用的dNTP特色，它們同時具有兩個修飾基團：一個熒光基團，一個可逆終止基團。A、G、C、T 4種堿基分別標記4種不同的熒光基團，它們在不同波長的激光激發(fā)下，能夠發(fā)射不同波長（即顏色）的熒光。熒光顏色與堿基種類一一對應，因此根據(jù)激發(fā)光的波長可以識別堿基。4種堿基的終止基團是一樣的。由于終止基團的存在，所有dNTP每次都只能延伸1個堿基，無論給予多長的反應時間。又由于該終止基團是可逆的，在熒光信號收集完畢之后，可以用剪切劑切除該終止基團，使堿基恢復自然的可延伸狀態(tài)，這時即可繼續(xù)進行下一輪循環(huán)，再測定一個堿基。

可逆終止基團技術是Illumina二代測序的一大特色。它與橋式PCR技術一起，構成了Illumina二代測序的兩大支柱，為穩(wěn)定獲得高質量的測序數(shù)據(jù)打下了堅實的基礎。

2 信號采集

HiSeq系列測序儀具有紅綠兩根激光管，兩個濾色片。它們兩兩組合，可以形成4種不同的激發(fā)波長，正好分別用于激發(fā)A、G、C、T 4種堿基。

Cluster上所標記的熒光基團在激光激發(fā)下產生的信號，可以用相機拍攝或者掃描的方式收集信號。掃描技術速度比較快，被X10系列采用。由于FC面積比較大，而且上表面和下表面要分別拍照，所以拍照過程相當耗時。對于經典的HiSeq 2000來說，一次測序循環(huán)所產生的熒光信號，需要大約40分鐘的時間才能拍照收集完畢，時間比測序反應本身還要長。

3 剪切

熒光信號收集完畢后，關閉激光，用剪切劑去除測序引物的延伸產物上的堿基所標記的熒光基團和終止基團。兩個修飾基團均被切除，一方面消去干擾熒光，一方面使鏈末端的堿基回復到自然的可延伸狀態(tài)，為下一輪測序做好準備。

再重復合成、激發(fā)、收集等步驟，即可進行第二個堿基的測序。

測序循環(huán)可以重復多次。理論上可以一直重復，直到信噪比降低得無法有效識別堿基信號為止。由于熒光基團的發(fā)光效率持續(xù)不斷在衰減，Taq酶的活性也在持續(xù)不斷地衰減，所以實際上測序循環(huán)次數(shù)是有限的，大重復次數(shù)與sbs試劑的配方有關。測序的循環(huán)次數(shù)可以在軟件設置過程中人為，這個重復次數(shù)就是每個測序片段的讀長。目前，Illumina平臺的讀長有2x100 bp，2x125 bp，2x150 bp，2x300 bp等多種，其中2x150 bp用得較廣泛。

單端測序：單端測序(Single-read)首先將DNA樣本進行片段化處理形成200-500bp的片段，引物序列連接到DNA片段的一端，然后末端加上接頭，將片段固定在flow cell上生成DNA簇，上機測序單端讀取序列。

雙端測序：雙端測序(Paired-end)方法是指在構建待測DNA文庫時在兩端的接頭上都加上測序引物結合位點，在*輪測序完成后，去除*輪測序的模板鏈，用對讀測序模塊(Paired-End Module)引導互補鏈在原位置再生和擴增，以達到第二輪測序所用的模板量，進行第二輪互補鏈的合成測序。

cDNA文庫：以mRNA為模板，經反轉錄酶催化，在體外反轉錄成cDNA，與適當?shù)妮d體(常用噬菌體或質粒載體)連接后轉化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。cDNA文庫特異地反映某種組織或細胞中，在特定發(fā)育階段表達的蛋白質的編碼基因，因此cDNA文庫具有組織或細胞特異性。

cDNA文庫是以特定的組織或細胞mRNA為模板，逆轉錄形成的互補DNA(cDNA)與適當?shù)妮d體(常用噬菌體或質粒載體)連接后轉化受體菌形成重組DNA克隆群，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織或細胞的cDNA文庫。cDNA文庫特異地反映某種組織或細胞中，在特定發(fā)育階段表達的蛋白質的編碼基因，因此cDNA文庫具有組織或細胞特異性

cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細胞特異表達的基因。但對真核細胞來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從cDNA文庫獲得的不同，基因組DNA文庫所含的是帶有內含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經過剪接、去除了內含子的cDNA。

真核生物基因組DNA十分龐大,其復雜程度是蛋白質和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重復序列. 采用電泳分離和雜交的方法,都難以直接分離到目的基因.這是從染色體DNA為出發(fā)材料直接克隆目的基因的一個主要困難。

高等生物一般具有10^5種左右不同的基因,但在一定時間階段的單個細胞或個體中,都僅有15%左右的基因得以表達,產生約15000種不同的mRNA分子.可見,由mRNA出發(fā)的cDNA克隆,其復雜程度要比直接從基因組克隆簡單得多。

cDNA文庫在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態(tài)及表達基因的功能鑒定方便具有特殊的優(yōu)勢，從而使它在個體發(fā)育、細胞分化、細胞周期調控、細胞衰老和死亡調控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應用價值，是研究工作中較常使用到的基因文庫。

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